制備凝膠懸浮液 
Sephadex  LH-20在使用之前必須進行溶脹。在溶脹的過程中，要盡量避免過分攪拌，否則會破壞球形膠粒，且要避免使用磁力攪拌器。
1．  在室溫下，將凝膠溶脹于層析溶劑中至少三小時，溶脹后膠體積的大小決定于所使用的溶劑系統，請參考后頁之干膠溶脹表計算特定柱體積所需要干膠的量。
2．  使溶脹膠體積沉淀之后占總體積的75%，上層溶劑占25%，這時，懸浮液從一個容器倒入另一容器時膠粒可移動。
3．  將溶脹后的凝膠根據裝柱要求均勻倒入柱內，在保證膠粒不變形的前提下，應在盡可能高的壓力下裝柱，反壓不要超過1.5ba。 
平衡 
上樣前，用洗脫液平衡層析柱至少兩個柱體積直到基線變得平穩為止，如改變溶劑應該注意凝膠在新溶劑中的溶脹性質，并根據性質確定柱高調節器的位置，如使用相同的溶劑，在以后的層析中柱平衡可以省略。 
洗脫液 
為確保延長層析柱的使用壽命，所有的緩沖液都應該離心或經過0.45um的膜過濾以除去雜質。 
樣品 
樣品體積應該占柱總體積的1-2%，同樣在使用之前樣品應該離心或經過0.45um的膜過濾。 
洗脫 
洗脫流速應根據情況而定，zui大張性流速約12cm/min（反壓1.5ba），建議流速為1-10cm/h。總體來說，較低的流速，具有較高的分辯率。