摘要：光散射檢測儀能夠直接測量分子量分布，因此在凝膠滲透色譜以及尺寸排除色譜法分析中起著重要作用。比較常用的是多角度光散射(MALS)檢測儀，因為在某些情況下，它們能為回轉半徑（Rg）的測量提供最精確的數據，而在另外一些情況下MALS已經成為公認的行業標準。馬爾文儀器公司新型Viscotek SEC-MALS 20檢測儀的推出，豐富了這一領域的產品選擇，并使該項技術成為業界矚目的焦點。

 

在本文中，馬爾文儀器將向您介紹MALS檢測儀的工作原理，總結它們在特定應用中的優勢，并重點介紹那些決定其性能的特點。本文可以作為幫助用戶判斷MALS在何種情況下最為適用的指南，并幫助那些有購置檢測新儀器的用戶作出明智的選擇。

 

Synopsis：Light scattering detectors play an important role in gel permeation chromatography and size exclusion chromatography analysis because of their ability to directly measure molecular weight distribution.

 

Multi angle light scattering (MALS) detectors are often chosen, in some instances because they provide the most accurate data for the measurement of the radius of gyration (Rg), and in others because they have become an accepted industry standard. The launch of the new Viscotek SEC-MALS by Malvern Instruments extends commercial choice in this area and draws the technology into the spotlight.

 

In this article Malvern Instruments explains how MALS detectors work, reviews their benefits for certain applications and highlights specific features that define performance. The resulting article provides a guide as to when MALS is the best choice and helps those investing in a new detector to make an informed choice.

 

關鍵詞：尺寸排阻色譜法, 凝膠滲透色譜法, 靜態光散射, 多角度光散射, 分子量測定, 色譜法, 光散射, 分子量

 

Key Words：Size exclusion chromatography, Gel permeation chromatography, Static light scattering, Multi angle light scattering, Molecular weight measurement, Chromatography, light scattering, molecular weight

 

光散射檢測器能夠直接測量分子量分布，因此在凝膠滲透色譜以及尺寸排除色譜法(GPC/SEC）分析中起著重要作用。有的時候會選擇多角度光散射(MALS)檢測器，因為在某些情況下，它們能夠準確檢測均方旋轉半徑（Rg）的數據，而在另外一些情況下MALS已經成為公認的行業標準。馬爾文儀器公司新型Viscotek SEC-MALS 20檢測器的推出，豐富了這一領域的產品選擇，并使該項技術成為業界矚目的焦點。

 

在本文中，馬爾文儀器納米顆粒和分子表征產品經理Mark Pothecary將向您介紹MALS檢測器的工作原理，總結它們在特定應用中的優勢，并重點介紹那些決定其性能的特點。本文可以作為幫助用戶判斷MALS在何種情況下最為適用的指南，并幫助那些有購置檢測新儀器的用戶作出明智的選擇。

 

 

為了精確測量分子量，GPC/SEC系統中越來越多地引入了光散射檢測器，這樣就無需借助傳統的外部校準方法。此外，當系統與粘度等其它檢測器結合使用時，還可以得到聚合物構形構像，支化等特征信息。

 

當分子被激光照射時，散射光的強度與其分子量直接相關，這種關系可以用瑞利方程來進行描述。如果能夠已知入射光束角度為0°時的散射光強度，那么瑞利方程的應用就能大大簡化。但是在這個角度進行測量并不可行，因為散射光信號很難與入射光信號區分開來。

 

這些年來，業界陸續開發出了多種不同的光散射技術，以各種不同的方式解決無法在0°角進行物理測量的難題。在這些方法中可以選擇的檢測技術包括：直角光散射（RALS）、小角度光散射（LALS）和多角度光散射（MALS）。根據分子的光散射行為不同，比如它們是各向同性還是各向異性的光散射體，可以對其進行分類，這對檢測器的選擇具有重要的影響。

 

小分子聚合物（通常指大小在10-15nm以下）各個角度的散射光強度都相同，因此可以在任何角度對這些各向同性散射體的散射光進行檢測。但是，對于較大的各向異性散射體，其散射光強度會受到角度不同的影響，這使得無法在0°測量的問題更趨復雜。

 

可以說，LALS是適用于所有類型大分子^[1]的最穩定可靠的檢測器。然而，MALS在某些領域的應用很廣，這主要是因為人們對它能進行多種測量、以及對回轉半徑（Rg）進行精確測量的獨特能力很有信心。Rg是一種很有用的參數，它能描述聚合物的大小，其中還包含了分子結構方面的信息。有些行業，尤其是與蛋白質或生物制藥領域相關的領域甚至對MALS檢測法進行了標準化。對于希望對這種技術應用進行優化的研究人員而言，掌握MALS檢測器的工作原理，了解不同檢測系統的利弊十分重要。

 

 

顧名思義，MALS是對分子從多個角度進行光強度測量，而并非局限在單一角度。這些測量結果可用于建立散射光隨入射角度變化的函數模型，從而推斷出0°入射光時的散射光強度.

 

這種推斷需要采用紀尼厄圖（也常稱作德拜曲線圖）來完成。圖1為瑞利比（Rayleigh ratio）圖，即散射光強度值對入射光角度的函數曲線圖。圖中的y截距即為入射光在0°時的光散射強度，而Rg則可根據斜率計算得出。

 

圖1：德拜圖描繪了瑞利比作為sin² (θ/2)的函數關系。y軸截距等于0°角下的瑞利比。

 

最簡單的MALS檢測器僅在兩個點上對散射光強度進行測量，這樣的系統樣品流量最小，樣品保留時間也最短，并且由于結構簡單而成為市面上最便宜的MALS檢測器。不過，單憑兩個角度的檢測是難以建立起可靠的校正曲線的，尤其是當德拜曲線呈非線性的時候，而這種情況又比較常見。由于上述雙檢測點系統的數據外推質量和擬合度較差，因而在多數情況下這種檢測系統的結果可靠性也較低。

 

現代MALS系統傾向于配備數量較多的檢測點，最先進的系統多達20個。因此，它們能夠擬合更加復雜的散射模式曲線，而不是簡單的直線。這對入射角度較小的情況來說特別重要，因為入射角度較小時，非線性特性會對所測量的分子量值產生很大的影響。與雙點檢測產品相比，上述多點檢測的系統能夠測得更精確的分子量和Rg數據。在選擇檢測系統時，檢測點的數量通常受到普遍的關注，但大家也應該認識到另外很重要的一點，就是盡管測量角度的增加使數據可靠推斷的可能性大大加強，但入射角度較小時，檢測器質量才是提高測量精度的最關鍵因素。

 

 

隨著MALS系統內檢測點數量的增加，儀器在技術上的要求就更為復雜。在檢測系統的設計中，既要考慮能夠容納多個點檢測，又要做到不降低信噪比，這一點至關重要。為此，制造商開發出一些替代配置，結合不同的小體積樣品池設計及其它一些特點，極大提高了MALS技術的測量精度。

 

任何MALS系統都有一個基本特點，就是配有樣品池，檢測點對置于其中的樣品進行測量。傳統MALS系統采用橫向樣品池設計，這樣，樣品就會以水平方式流經檢測點。入射的激光束通過樣品池端部射入，并按照與樣品流動相一致的方向穿過樣品池。檢測點被設計在流動相的同一平面上，并通過透鏡將光線聚焦其上。

 

圖2：傳統MALS檢測器采用橫向樣品池，樣品沿入射光束同一平面進入該樣品池。

 

橫向樣品池設計可容納多個檢測點，但不一定具備小角度測量的最佳敏感度。對于這種結構，必須使用大樣品池，以容納更多數量的檢測點。大樣品池占用的體積會明顯增加，并限制了檢測點在低角度位置的可用物理空間。此外，由此造成的較淺入射角和折射角往往會使小角度測量的信噪比較差，從而降低測量精度。最后，由于不同流動相會引起折射率的變化，因此需要采用不同的透鏡來對入射角和折射角進行校正。

 

以馬爾文的Viscotek SEC-MALS 20為例，較新的MALS檢測器都已重點采用垂直樣品池，以突破橫向樣品池設計固有的局限性。在這種結構中，流動相和激光彼此垂直，并且和橫向系統一樣可以容納多個測量角度，但這種設計可以使小角度測量具有更大的物理空間，從而提高了準確測量的概率。

 

圖3：在垂直樣品池中，光線總是以90°射出池壁，使干擾最小化并且無需對折射率進行修正。

 

在垂直樣品池設計中，散射光垂直于池壁射出，最大限度地減少了流動相和池壁界面處產生的干擾，并且流動相折射率的變化也不會對測量角度造成影響。這意味著單個樣品池可以處理任何溶劑或任何一種折射率。

 

 

蛋白質聚集被認為是生物制藥行業和其它相關領域的一個重要問題。蛋白質具有隨時間推移而聚集的傾向，對多克隆抗體和單克隆抗體等生物藥物而言，蛋白質聚集體的存在會造成降低療效和可能刺激免疫反應的風險。GPC/SEC系統經常用于測量蛋白質分子量，并對出現的任何聚集體進行檢測和表征。下面所舉的案例對MALS檢測器在蛋白質聚集體研究中的應用^[2]進行了詳細說明。

 

在這一案例中，將一臺Viscotek SEC-MALS 20檢測器與一臺ViscotekTDAmax（均由英國馬爾文儀器公司制造）相連接，組成了包含多檢測器陣列的GPC/SEC系統，用來對胃蛋白酶樣品進行表征。胃蛋白酶是由胃內主細胞產生的酶。在進行分析之前，將樣品溶解于磷酸鹽緩沖液組成的流動相中。

 

GPC/SEC對胃蛋白酶樣品的分析顯示出兩個明顯的峰值。一種組分的分子量測定為34.5kDa，對應于已知胃蛋白酶的分子量35kDa。另一個組分的分子量要高得多，認定該物質為一種聚集體物質。還出現了無法明確識別的第三個組分，分子量約為6kDa。作為消化酶，很可能樣本中的胃蛋白酶已經開始消化自身，第三個組分表明出現了一些降解產物。

 

圖4 ：胃蛋白酶色譜圖。34.5 kDa的峰值對應胃蛋白酶已知分子量，更早的保留時間對應的峰值則由蛋白質聚集引起。

 

盡管產生了顯著的光散射峰值，但樣品中聚集體僅占材料總量不到1％。識別和量化藥物樣品中的這類化合物，對于藥物開發和遵守嚴格的藥品監管標準來說至關重要。

 

雖然胃蛋白酶單體太小，無法進行Rg測量，但MALS圖表明聚集體材料是一種強烈的各向異性光散射體，因此能夠計算出聚集物質的Rg值（參見表1）。

 

表1 ：進行胃蛋白酶分析所需的計算參數。使用MALS可以實現聚集體成分的回旋半徑計算。

	聚集體	單體	降解產物
RV(保留體積)峰值(ml)	10.84	18.33	20.92
Mn– (kDa)	3892.0	34.4	4.7
Mw – (kDa)	4431.0	34.7	6.4
Mw / Mn	1.138	1.008	1.364
Rg (w) – (nm)	69.9	N/C	N/C
Wt Fr (峰值)	0.008	0.569	0.423

 

 

MALS是目前廣泛應用于整個蛋白質、聚合物和高分子表征領域的一種GPC/SEC光散射技術。MALS在生物制藥行業十分盛行，而其對Rg進行計算的能力也在另一些行業受到了高度重視。因此，如何選擇一臺合適的MALS檢測器是擺在許多人面前的一項重要任務。了解MALS檢測器器的關鍵特性，不僅能幫助用戶做出決定，還能幫助用戶真正獲得這一最新創新帶來的實際利益和價值。

 

[1]馬爾文儀器白皮書《靜態光散射技術的GPC / SEC解釋》。可訪問以下網址下載：www.malvern.com/slsforgpc

[2] 馬爾文儀器應用筆記《采用Viscotek SEC-MALS 20對蛋白質聚集進行測量》。可訪問以下網址下載：www.malvern.com/secmals20

 

 

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