圖中展示的就是構成酵母線粒體大核糖體亞單位(yeast mitochondrial large ribosomal subunit)的各個組成蛋白質(zhì)。Amunts等人根據(jù)利用低溫冷凍電鏡技術獲得的酵母線粒體大核糖體亞單位及完整核糖體的結構圖譜，一個個地合成出了上述這些組分蛋白。這個經(jīng)過不斷完善的結果與根據(jù)X線晶體成像技術獲得的原子模型非常吻合。
先進的低溫冷凍電鏡(cryo–electron microscopy)技術讓我們獲得了大量高分辨率的蛋白質(zhì)結構圖。
結構生物學(structural biology)研究的主要目的就是獲得用于構成活體細胞的各種各樣大分子(macro-molecules)生物組件的高分辨率圖像信息。該研究主要依賴的技術手段就是X線晶體照相術(x-ray crystallography)以及核磁共振光譜分析檢測技術(nuclear magnetic resonance spectroscopy, NMR spectroscopy)。不過這兩種技術都有各自的局限性，比如X線晶體照相術只能夠?qū)ιL得極為有序的三維結晶進行觀察，而核磁共振光譜分析檢測技術則要求被檢測樣品的純度非常高，不能夠有重疊峰出現(xiàn)。有很多生物大分子相互結合、組裝之后形成的都是非常大的，或者非常不穩(wěn)定、比較罕見的結構，都不太適合用上述這兩種技術進行分析和檢測。單粒子電子顯微鏡技術(Single-particle electron microscopy, EM)則能夠觀察少量非結晶樣品，獲得高分辨率的結構圖譜。
使用單粒子電子顯微鏡技術可以獲得任意排列方向的分子復合體( molecular complexes)的結構圖像。該技術會從每一幅圖像中選出單個的復合體(粒子)，然后借助計算機來判斷它們的排列方向。最后將各個不同視角的圖像組合在一起，得到該分子的三維立體圖像。不過由于高能電子束會對生物大分子起到破壞作用，打斷分子內(nèi)的共價鍵(covalent bonds)，并且誘發(fā)一系列級聯(lián)式的有害化學反應，所以這種放射性損傷效應給單粒子電子顯微鏡技術帶來了極大的局限性，在實驗時用來記錄影像的電子束的能量受到了非常大的約束。
20世紀80年代，Dubochet等人報道了一種單粒子電子顯微鏡技術革新成果，將該技術引向了高分辨率成像之路。他們在低溫條件(cryogenic conditions)下將待檢樣品放在一層薄薄的、透明的冰上用單粒子電子顯微鏡進行成像觀察。這種方法就是所謂的“低溫冷凍電鏡技術(cryo–electron microscopy, cryo-EM)”，他能夠?qū)牧Ｗ?hydrated particles)進行直接成像。低溫除了具有這些優(yōu)勢之外，還能夠減少電子束對樣品產(chǎn)生的放射性損害。不過電子束的照射量還是不能夠太大，只有這樣才能夠清晰地反映出分子結構的細節(jié)，獲得高質(zhì)量的、低信噪比(signal-to-noise ratio, SNR)的三維結構圖像。由于將每個分子的多張圖像信息組合在一起能夠更進一步地降低圖像的信噪比，所以，對數(shù)萬、乃至數(shù)百萬個蛋白質(zhì)復合體進行分析就會產(chǎn)生數(shù)十萬張圖像。
不過依靠低溫冷凍電鏡圖像來判斷生物大分子的結構給計算機處理分析工作帶來了一大挑戰(zhàn)。在借助多圖像組合平均手段來改善信噪比時，必須知道每一顆粒子的方向，但是由于信噪比太低，我們對這些粒子方向的判斷又明顯感覺準確性不夠，這就形成了一個矛盾。要解決這個問題，最成功的方法就是“重復(iterative)”，質(zhì)量高的圖像能夠給出更準確的方向信息，而這些方向信息又可以幫助我們獲得更高質(zhì)量的圖像。
直到最近這一段時間，絕大部分單粒子低溫冷凍電鏡圖片的分辨率都非常低，連10埃都達不到，所以很多人都將這種技術嘲笑為 “一團漿糊學(blob-ology)”。蛋白質(zhì)二級結構中的α螺旋(α helices)結構只有在分辨率達到9~10埃，甚至更高分辨率的情況下才能夠看清;而另外一種二級結構，β折疊(β strands)結構則只有在分辨率達到4.8埃以上時才能夠看清。達到3.5埃的分辨率，就可以為蛋白質(zhì)或核酸等生物大分子構建原子模型(atomic models)，將各種目前已知的核酸結構或氨基酸結構填入其中了。如果要了解蛋白質(zhì)復合體形成時發(fā)生的各種化學變化，就必須獲得原子級別分辨率的細節(jié)信息。低分辨率的結構信息也不是一無是處，當在與高分辨率結晶圖像相互配合、印證，用來判斷組成復合體的各種不同組分時更加有意義。因此，即便分辨率較低，低溫冷凍電鏡技術也還是幫助科學家們解決了很多生物學難題，比如解析出了與其他輔因子共同結合的核糖體的結構問題，以及構象只能夠維持片刻時間的核糖體瞬時結構等問題。
在過去的三十年，低溫冷凍電鏡設備取得了長足的進展，在樣品制備、成像、計算機處理等實驗技術方面有了一定的提升，這些使低溫冷凍電鏡成像技術的分辨率有了極大的提高。高度連貫的場發(fā)射電子槍(Highly coherent feld-emission electron guns)也使保留焦點以外的圖像的高分辨率信息成為可能，這對于單粒子低溫冷凍電鏡非常有幫助。這種技術創(chuàng)新幫助科研人員獲得了20面體病毒粒子(icosahedral virus particles)的圖像，而且清楚地看到了其中的α螺旋結構。由于這種病毒是高度對稱的，所以比較容易生成高質(zhì)量的、最佳分辨率的低溫冷凍電鏡圖像。
隨著研究人員不斷地開發(fā)出更穩(wěn)定的載物臺、更好的顯微鏡抽真空技術，以及自動化的數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)，這一切的技術進步都讓我們能夠獲得更多、質(zhì)量更好的電鏡圖像，因此才能夠得到高質(zhì)量的、能夠?qū)ζ渲械陌被醾?cè)鏈進行解析的二十面體病毒粒子三維結構圖像，以及分辨率達到5埃的核糖體結構圖像。不過在對更小一點的非對稱粒子的解析工作中還是很難解析到α螺旋結構。
最近在低溫冷凍電鏡設備領域取得的最大進展就是引入了直接檢測設備(direct detector device, DDD)照相機。這種DDD設備能夠直接在傳感器上記錄圖像，從而繞過了傳統(tǒng)的、需要閃爍設備和光纖的電荷耦合裝置(charge-coupled device, CCD)探測器，以及其他一些在用攝影膠片(photographic film)記錄圖像時必須要經(jīng)過的繁雜的處理過程。因此，圖像的信噪比也得到了極大的提升。在分辨率方面的提升也與之前的一些革新手段相當。在使用了DDD設備之后，還有可能在電鏡圖像中直接構建原子模型，甚至能夠在最具挑戰(zhàn)性的檢測工作中進行α螺旋和β折疊的解析工作。
DDD設備的引入還在另外一個方面對低溫冷凍電鏡的圖像起到了改善作用，憑借的就是該設備極快的讀出速度(readout rate)，該讀出速度能夠發(fā)現(xiàn)被冰包裹的被觀測粒子在電子束中的運動情況。使用DDD設備不僅能夠發(fā)現(xiàn)這種問題，還能夠解決這種問題，因為現(xiàn)在的電鏡就好像是一臺攝像機，可以拍攝一段錄影，記錄整個過程，而不再像以前那樣，只是一臺照相機，只能夠拍攝出一張張固定的圖像。
有了高質(zhì)量的圖像，又有可以借助計算機對因為電子束而移位的粒子進行矯正的工具，我們就可以獲得大量高質(zhì)量的低溫冷凍電鏡圖像，比如本文開頭展示的那張分辨率高達3.2埃的線粒體核糖體亞單位圖像，以及下圖那張分辨率達到3.3埃的20S蛋白酶體圖像和哺乳動物感受器通道TRPV1的圖像。 TRPV1的圖像尤其值得一提，因為TRPV1蛋白是一種膜蛋白，只有四級對稱性(four-fold symmetry)，比核糖體要小一個數(shù)量級。所以之前大家一直都認為很難用低溫冷凍電鏡對該蛋白進行結構解析的研究工作。有了 DDD成像技術、更好的計算機輔助和生物化學技術之后，Liao等人終于在某些區(qū)域獲得了分辨率高達3.4埃的圖像，從而有機會開展原子建模工作，在整個結構生物學(structural biology)發(fā)展歷史上寫下了重重的一筆。
單粒子低溫冷凍電鏡結構解析圖。左圖展示的是隨機排列的蛋白質(zhì)粒子在電鏡下的圖像，這些圖像經(jīng)過計算機處理之后可以用來計算大分子復合物的三維立體結構圖像。由于有了DDD技術，左邊的這些圖像信息就可以構建出右圖中展示的原子模型。圖中展示的就是20S蛋白酶體的結構圖。
乍一看上去，這些成果都好像是特例。比如核糖體里由于含有大量的RNA，所以是一幅高度緊縮的圖像，非常緊密，不太容易受到輻射的損失。而20S蛋白酶體擁有14級對稱性，所以也非常適于進行低溫冷凍電鏡成像操作。即便是TRPV1通道蛋白也都擁有一定的內(nèi)部對稱性。但是最近剛剛成功獲得的一幅電鏡圖像就完全不具備上述這些“先天優(yōu)勢”，這就是分辨率達到4.5埃的人γ分泌酶復合物(γ-secretase)的結構圖。人γ分泌酶復合物是一種更小的膜蛋白復合體，完全沒有對稱性。該成果說明，只要待測樣品能夠準備得恰當，盡可能減少其在結構上的異質(zhì)性，我們就完全有可能利用低溫冷凍電鏡技術獲得各種蛋白質(zhì)的三維立體結構圖。
這些科研新進展恰好出現(xiàn)在低溫冷凍電鏡技術的低谷期。最近剛剛獲得的HIV-1病毒糖蛋白三聚體結構模型就引起了極大的爭議，因為多位電鏡專家都堅持認為，這個結構模型不僅在結構上不準確，就連用來進行分析的原始圖像也都沒有真實地反映該三聚體的真實信息。這場爭論也讓我們意識到，我們目前的確沒有太多的手段對低溫冷凍電鏡圖像的質(zhì)量進行驗證，雖然有一些手段，但是都沒有得到廣泛的推廣和應用，另外也缺乏一套規(guī)范，圖像的信號非常差，所以也很難判斷最終得出的結構圖是否就是被測樣品的結構。這是一個非常值得關注的問題，不僅僅是因為這次的HIV-1病毒糖蛋白三聚體結構模型具有重大的科研價值，比如在HIV疫苗的開發(fā)工作中會起到非常重要的指導作用等。
在結構解析方面還有大量的工作需要我們?nèi)ネ晟疲悍奖闶褂玫娘@微鏡相板(phase plates)有助于更好地聚焦，獲得高對比度的圖像，就好像相襯光學顯微鏡(phasecontrast light microscopy)那樣，這能夠讓對圖像進行信息采集的工作更加簡便，而且質(zhì)量更高。另外在探測器方面也可以進一步提高圖像的質(zhì)量。即便是最先進的探測器也達不到符合理論要求的表現(xiàn)。各種用來進行圖像分析的計算機軟件，比如用來矯正電子束相關移位的軟件，或者對各種粒子進行分類、解讀的軟件也將會變得越來越強大。新型的樣品承載系統(tǒng)會進一步減少電子束對樣品的位移作用。更加可靠的、更加強大的驗證工具可以讓我們更
有信心，保證不會納入質(zhì)量不高的原始圖片素材。雖然現(xiàn)在還不知道低溫冷凍電鏡技術未來會走向何方，但是有一點是可以肯定的，那就是低溫冷凍電鏡圖像絕對不再是一團漿糊了。
